真菌毒素的检验（四） 真菌加入100mL甲醇+水(8+2)(V1)

4、真菌分析步骤

(1)试样的毒素的检制备

①谷物：在粉碎机中粉碎并通过庐2mm圆孔筛。

②啤酒：使用前先置于0～4℃冰箱冷藏1h，真菌启盖，毒素的检倒入锥形瓶中在振荡器上振摇消泡。真菌

(2)免疫亲和柱色谱净化高效液相色谱法(快速确证方法)

①提取

a．谷物(小麦、毒素的检大麦、真菌玉米)：准确称取试样50.0g(准确到0.1g)于均质器配置的毒素的检搅拌杯中，加入5.0g氯化钠，真菌加入100mL甲醇+水(8+2)(V₁)。毒素的检将搅拌杯置于均质器上，真菌于20000r／min高速搅拌提取1min。毒素的检提取液经槽纹折叠滤纸过滤于干净的真菌烧杯中。准确移取10.0mL(V2)滤液并加入40.0mL水(V₂)稀释，毒素的检混合均匀，真菌经玻璃纤维滤纸直接过滤入10mL注射器。

b．酒类(啤酒、葡萄酒、黄酒)：准确移取试样10mL于100mL烧杯中，加入10mLl％聚乙二醇+5％碳酸氢钠溶液(V₁总量应为20mL)，用玻璃棒搅拌均匀。准确移取10.0mL(V₂)经玻璃纤维滤纸直接过滤入10mL注射器。

②净化

a．谷物：将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取10.OmL(V₄)样品提取液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过免疫亲和柱。以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过免疫亲和柱。准确加入1.OmL(V)甲醇洗脱，流速为1～2mL/min。收集全部洗脱液于玻璃试管中。

b．酒类：将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL(V₄)样品提取液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过免疫亲和柱。以5mL淋洗溶液、5mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过免疫亲和柱。准确加入1.0mL(V)甲醇洗脱，流速为1～2mL/min。收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

③测定

a．高效液相色谱条件激发波长360nm；发射波长420nm。

色谱柱：C₁₈柱(柱长150mm，内径3.0mm，填料直径5μm)。

流动相：乙腈-0.012mol/L磷酸钠溶液。进样量：20μL。

b．操作：用微量注射器吸取20μL赭曲霉毒素A标准工作溶液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定标准溶液的响应值(峰高或峰面积)，得到赭曲霉毒素A标准溶液高效液相色谱图。

用微量注射器吸取20μL样品洗脱液注入高效液相色谱仪，在上述色谱条件下测定试样的响应值(峰高或峰面积)。经过与赭曲霉毒素A标准溶液谱图比较响应值得到试样中赭曲霉毒素A的浓度(c)。

④空白试验用水代替试样，按上述步骤做空白试验。

⑤结果计算：样品中赭曲霉毒素A的含量(X)以μg/kg表示，按式1计算：

其中：

式中：X₁——样品中赭曲霉毒素A的含量，μg/kg；

c₁——试样中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；

c_o——空白试验中赭曲霉毒素A的含量，μg/L；

V——最终甲醇洗脱液体积，mL；

W——最终净化洗脱液所含的试样质量，g；

m——试样称取的质量的数值，g；

V₁——样品和提取液总体积，mL；

V₂——稀释用样品滤液体积，mL；

V₃——稀释液体积，mL；

V₄——通过免疫亲和柱的样品提取液体积，mL。

⑥测定低限：免疫亲和柱色谱净化高效液相色谱法测定谷物、酒类、藤蔓水果干、香辛料的低限均为1μg／kg(μg/L)。

(3)免疫亲和柱色谱净化荧光光度法(快速筛选方法)

①提取

a．谷物(小麦、大麦、玉米)同(2)①a。

b．酒类(啤酒、白葡萄酒、黄酒)：准确移取试样50mL于均质器配置的搅拌杯中，加入50mL 1％碳酸氢钠溶液(V1总量应为100mL)，以20000r/min高速搅拌提取1min，静置。准确移取10.0mL(V₂)并加入40.0mL纯水(V₃)稀释，用玻璃纤维滤纸直接过滤入10mL注射器。

②净化

色谷物同(2)②a操作至“以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过免疫亲和柱”为止。准确加入1.5mL(V)洗脱溶液洗脱，流速为1～2mL／min。收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

b．酒类(啤酒、白葡萄酒、黄酒)：将免疫亲和柱连接于10mL玻璃注射器下。准确移取10.0mL( V₄)样品提取液于玻璃注射器中，将空气压力泵与玻璃注射器相连接，调节压力使溶液以约6mL/min流速缓慢通过免疫亲和柱，直至2～3mL空气通过免疫亲和柱。以10mL淋洗溶液、10mL水先后淋洗免疫亲和柱，弃去全部流出液，并使2～3mL空气通过免疫亲和柱。准确加入1.5mL(V)洗脱溶液洗脱，流速为1～2mL/min。收集全部洗脱液于玻璃试管中，供检测用。

③测定：荧光光度计仪器条件激发波长360nm，发射波长440nm。

荧光光度计校准以0.05moL/L硫酸溶液为空白，调节荧光光度计的读数值为0；以荧光光度计校准溶液调节荧光光度计的读数值为36。

样液测定将洗脱液立即置于荧光光度计中读取样液中赭曲霉毒素A的浓度(c)。

④空白试验用水代替试样，按上述步骤做空白试验。

⑤结果计算：                    

⑥测定低限：免疫亲和柱色谱净化高效液相色谱法测定谷物、酒类、藤蔓水果干、香辛料的低限均为1μg／kg(μg/L)。

5、结果

(1)色谱图：图为赭曲霉毒素A标准溶液的高效液相色谱图。

（2）浓度与响应值的线性关系 赭曲霉毒素A系列标准溶液的液相色谱浓度与响应值的线性关系

线性方程：y=3.185021x-0.075619(R=0.9999)

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